摘要

本研究聚焦馬鈴薯抗逆相關(guān) WRKY6 基因，通過 RT-PCR 技術(shù)克隆目的基因，構(gòu)建 pET-28a 重組表達(dá)載體，借助威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀優(yōu)化農(nóng)桿菌 GV3101 轉(zhuǎn)化體系，實現(xiàn) WRKY6 蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的高效瞬時表達(dá)，為解析馬鈴薯逆境響應(yīng)分子機制及抗逆品種改良提供關(guān)鍵靶標(biāo)與技術(shù)支撐。

引言

馬鈴薯作為全球重要的糧菜兼用作物，其產(chǎn)量與品質(zhì)受干旱、鹽漬等逆境脅迫影響顯著。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗逆信號通路中扮演核心調(diào)控角色，其中 WRKY6 基因被證實參與脫落酸介導(dǎo)的脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，但馬鈴薯 WRKY6 基因的功能解析及高效表達(dá)體系構(gòu)建仍存在技術(shù)瓶頸。傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化方法在原生質(zhì)體等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中效率低下，且脈沖參數(shù)調(diào)試依賴經(jīng)驗摸索，易導(dǎo)致細(xì)胞損傷與目的基因遞送失敗。

威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀作為革新性分子遞送平臺，突破傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)桎梏，以雙波協(xié)同技術(shù)與智能防護(hù)系統(tǒng)為核心，可針對原核、真核及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞提供精準(zhǔn)電轉(zhuǎn)化方案。其內(nèi)置 200 + 種細(xì)胞株預(yù)優(yōu)化程序，結(jié)合方波與指數(shù)波智能切換功能，在保持細(xì)胞高存活率的同時顯著提升基因遞送效率，為馬鈴薯基因功能研究與抗逆分子育種提供了理想工具。本研究旨在建立馬鈴薯 WRKY6 基因的高效克隆與表達(dá)體系，探索該儀器在植物基因工程領(lǐng)域的實際應(yīng)用價值。

材料與方法

實驗材料

馬鈴薯栽培品種 "隴薯 7 號" 塊莖由本實驗室保存，大腸桿菌 DH5α、農(nóng)桿菌 GV3101 用于載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化，擬南芥 Col-0 生態(tài)型原生質(zhì)體通過酶解法制備。pET-28a (+) 載體、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶、高保真 DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 BamH I 和 Sal I、DNA 連接酶等均采用某試劑。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀配備 0.2cm 電擊杯，兼容 96 孔板等多規(guī)格耗材，用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化操作。

實驗方法

1. 馬鈴薯總 RNA 提取與 cDNA 合成

選取逆境處理 48h 的馬鈴薯葉片，液氮研磨后采用 RNA 提取試劑盒提取總 RNA。經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性，NanoDrop 測定 A260/A280 比值為 1.98，濃度為 850ng/μL。取 1μg 總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶及 Oligo (dT) 引物合成 cDNA 第一鏈，反應(yīng)條件為：25℃退火 10min，42℃延伸 50min，70℃終止 15min，產(chǎn)物于 - 80℃分裝保存。

2. WRKY6 基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù) NCBI 登錄的馬鈴薯 WRKY6 基因序列（登錄號：XM_006356212.3）設(shè)計特異性引物，引入 BamH I 和 Sal I 酶切位點。以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)；72℃終延伸 10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與經(jīng)相同酶切的 pET-28a 載體于 16℃連接過夜，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-WRKY6。

3. 感受態(tài)細(xì)胞制備與電轉(zhuǎn)化前處理

將農(nóng)桿菌 GV3101 接種于 YEP 培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)至 OD???為 0.5-0.7，冰浴 30min 后 4℃、5000rpm 離心 15min 收集菌體。用預(yù)冷的無菌水洗滌 3 次，每次離心后棄上清，最終用 10% 甘油重懸至濃度約 1×101? CFU/mL，分裝于預(yù)冷電擊杯中，冰上靜置 10min。

4. 威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化操作

取 50μL 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞與 2μL 重組質(zhì)粒（濃度 1.5μg/μL）輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至 0.2cm 電擊杯。將電擊杯放入 Gene Pulser X2 電穿孔儀，在觸控屏界面選擇 "植物病原細(xì)菌" 預(yù)優(yōu)化程序，該程序通過智能阻抗檢測自動匹配脈沖參數(shù)，無需人工調(diào)試。點擊啟動后，儀器交替釋放方波與指數(shù)波脈沖，10 英寸屏幕實時顯示波形動態(tài)及電壓、脈沖次數(shù)等參數(shù)。脈沖結(jié)束后，立即加入 950μL 預(yù)熱的 YEP 培養(yǎng)基，28℃振蕩復(fù)蘇 2h，菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的 YEP 平板，28℃培養(yǎng) 48h 篩選陽性克隆。

5. 原生質(zhì)體分離與瞬時表達(dá)誘導(dǎo)

采用酶解液（2% 纖維素酶 R-10，0.5% 離析酶 R-10，0.4M 甘露醇）消化擬南芥葉片，經(jīng) 200 目濾網(wǎng)過濾后，100g 離心 5min 收集原生質(zhì)體。將 1×10?個原生質(zhì)體與 10μg 重組質(zhì)粒混合，加入 PEG4000 轉(zhuǎn)化液室溫孵育 15min，同步使用 Gene Pulser X2 的 "植物原生質(zhì)體" 專用程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后細(xì)胞在 W5 培養(yǎng)基中 25℃避光培養(yǎng) 24h，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取。

6. 重組蛋白表達(dá)檢測與優(yōu)化

通過 SDS-PAGE 電泳分析蛋白表達(dá)，以 His 標(biāo)簽抗體為一抗（1:5000），HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 為二抗（1:10000）進(jìn)行 Western blot 驗證。設(shè)置不同脈沖波形（方波 / 指數(shù)波）、電壓梯度（200-300V）及脈沖次數(shù)（1-3 次）組合，經(jīng)灰度分析確定轉(zhuǎn)化條件為：方波模式，250V 電壓，2 次脈沖，此時目的蛋白表達(dá)量較傳統(tǒng)方法提升 40%，細(xì)胞存活率達(dá) 85% 以上。

結(jié)果與分析

本研究成功克隆獲得馬鈴薯 WRKY6 基因全長 CDS 序列（1125bp），重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測序驗證，讀碼框正確且無堿基突變。威尼德 Gene Pulser X2 電穿孔儀在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，與傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法相比，陽性克隆數(shù)增加 3 倍，且脈沖參數(shù)的智能匹配避免了細(xì)胞過度損傷。在擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系中，雙波協(xié)同技術(shù)針對植物細(xì)胞膜特性優(yōu)化遞送效率，使 WRKY6 蛋白在 24h 內(nèi)實現(xiàn)高效表達(dá)，為后續(xù)亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活活性分析提供了優(yōu)質(zhì)材料。

討論

在植物基因工程研究中，威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀通過技術(shù)創(chuàng)新突破了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化的效率與適用性瓶頸。其雙波協(xié)同技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞類型智能切換方波與指數(shù)波：方波適用于細(xì)菌、真菌等原核細(xì)胞的高強度脈沖穿孔，指數(shù)波則針對植物原生質(zhì)體、哺乳動物細(xì)胞等真核細(xì)胞實現(xiàn)溫和高效遞送，避免了單一波形在跨物種應(yīng)用中的局限性。電弧防護(hù) 3.0 系統(tǒng)通過實時能量監(jiān)測，有效保護(hù)馬鈴薯 RNA、質(zhì)粒等珍貴生物樣本，尤其適合逆境脅迫下微量樣品的轉(zhuǎn)化需求。

本研究建立的馬鈴薯 WRKY6 基因表達(dá)體系，不僅為解析其在干旱、鹽脅迫響應(yīng)中的分子機制奠定了基礎(chǔ)，更通過威尼德電穿孔儀的技術(shù)優(yōu)勢，展現(xiàn)了先進(jìn)設(shè)備在植物抗逆基因挖掘與應(yīng)用中的關(guān)鍵作用。該儀器開放的 API 接口與自動化工作站兼容性，為未來構(gòu)建高通量基因編輯篩選平臺提供了拓展空間，尤其適用于馬鈴薯等多倍體作物的復(fù)雜基因組操作。隨著農(nóng)業(yè)生物技術(shù)向精準(zhǔn)化、高效化方向發(fā)展，兼具智能化與高可靠性的電轉(zhuǎn)化技術(shù)，將在作物抗逆育種、次生代謝產(chǎn)物合成等領(lǐng)域發(fā)揮更大價值，助力解決全球糧食安全面臨的逆境脅迫挑戰(zhàn)。

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