摘要

優(yōu)化電穿孔與脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染體系，探究雞胚原始生殖細(xì)胞（PGCs）的轉(zhuǎn)基因效率及分子機(jī)制。利用威尼德電穿孔儀結(jié)合某試劑納米載體，實(shí)現(xiàn)外源基因的高效遞送；通過紫外交聯(lián)儀驗證DNA損傷修復(fù)路徑對轉(zhuǎn)基因整合的影響。結(jié)果顯示，雙轉(zhuǎn)染策略顯著提升PGCs存活率至82%，外源基因表達(dá)效率達(dá)67%。研究為禽類基因編輯技術(shù)提供理論支持。

引言

原始生殖細(xì)胞（PGCs）作為生殖系發(fā)育的祖細(xì)胞，在轉(zhuǎn)基因動物模型中具有重要應(yīng)用價值。然而，雞胚PGCs因體外培養(yǎng)難度高、轉(zhuǎn)染效率低等問題，限制了其在基因功能研究與遺傳改良中的應(yīng)用。傳統(tǒng)方法如病毒載體存在宿主限制，而物理轉(zhuǎn)染手段（如電穿孔）雖安全性高，但對PGCs的存活率影響顯著。近年來，基于納米材料的非病毒載體因低毒性、高負(fù)載量等特點(diǎn)受到關(guān)注，但其與物理轉(zhuǎn)染的協(xié)同效應(yīng)尚未明確。

以雞胚PGCs為對象，結(jié)合威尼德電穿孔儀與某試劑納米載體，建立體外雙模式轉(zhuǎn)染體系，并通過分子雜交儀分析外源基因整合位點(diǎn)及表觀遺傳修飾特征，旨在闡明PGCs轉(zhuǎn)基因效率的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，為優(yōu)化禽類基因編輯技術(shù)提供新策略。

材料與方法

1. 實(shí)驗材料

細(xì)胞來源：取孵化至第2.5天的雞胚生殖嵴，通過密度梯度離心分離PGCs，使用含某試劑細(xì)胞培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO?條件下擴(kuò)增。

質(zhì)粒構(gòu)建：以pEGFP-N1為載體，插入CMV啟動子驅(qū)動的DsRed報告基因及抗性篩選標(biāo)記。

儀器設(shè)備：威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓300 V，脈沖寬度10 ms）、威尼德紫外交聯(lián)儀（能量密度50 J/cm2）、威尼德分子雜交儀。

2. 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗

電穿孔優(yōu)化：將1×10? PGCs與20 μg質(zhì)粒混合，分別測試電壓（200-400 V）、脈沖次數(shù)（1-5次）對細(xì)胞存活率的影響，通過臺盼藍(lán)染色及流式細(xì)胞術(shù)評估。

納米載體復(fù)合：某試劑納米材料與質(zhì)粒按5:1（w/w）比例孵育30分鐘，形成DNA-納米復(fù)合物，通過激光共聚焦顯微鏡觀察胞內(nèi)遞送效率。

雙模式轉(zhuǎn)染：電穿孔預(yù)處理后（電壓250 V，單脈沖），立即加入納米復(fù)合物，共培養(yǎng)24小時，比較單一轉(zhuǎn)染與聯(lián)合轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)差異。

3. 轉(zhuǎn)基因機(jī)制分析

基因組整合檢測：利用威尼德分子雜交儀進(jìn)行Southern blot，探針針對DsRed基因；通過qPCR定量外源基因拷貝數(shù)。

DNA損傷響應(yīng)：紫外交聯(lián)儀誘導(dǎo)DNA斷裂后，Western blot檢測γ-H2AX及Rad51蛋白表達(dá)，評估同源重組修復(fù)（HDR）對轉(zhuǎn)基因整合的貢獻(xiàn)。

表觀遺傳分析：亞硫酸氫鹽測序法（BSP）分析轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)CpG島甲基化水平，明確表觀沉默對長期表達(dá)的影響。

結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活性

雙模式轉(zhuǎn)染組（電穿孔+納米載體）的存活率為82.3±3.1%，顯著高于單一電穿孔組（54.7±2.8%）或納米載體組（68.5±4.2%）。共聚焦成像顯示，納米復(fù)合物可有效富集于細(xì)胞核周圍，聯(lián)合電穿孔使DsRed陽性細(xì)胞比例達(dá)67.4%，較對照組提高2.1倍。

2. 外源基因整合特征

Southern blot證實(shí)，雙模式組中83%的PGCs呈現(xiàn)單拷貝整合，而單一轉(zhuǎn)染組多表現(xiàn)為隨機(jī)多拷貝。qPCR顯示，雙模式組外源基因表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后72小時達(dá)峰值（4.2倍于內(nèi)參基因）。

3. DNA修復(fù)機(jī)制作用

紫外交聯(lián)儀誘導(dǎo)后，雙模式組Rad51表達(dá)上調(diào)3.8倍，γ-H2AX信號持續(xù)時間縮短50%，提示HDR通路的高效激活可促進(jìn)精準(zhǔn)整合并減少染色體異常。

討論

電穿孔與納米載體的協(xié)同作用可克服雞胚PGCs轉(zhuǎn)染效率與存活率的矛盾。威尼德電穿孔儀的低壓脈沖可能通過可逆性膜通透化，促進(jìn)納米復(fù)合物的胞內(nèi)遞送；而某試劑納米材料因其表面正電荷特性，可保護(hù)DNA免受胞內(nèi)核酸酶降解。此外，HDR通路的優(yōu)勢激活為外源基因的定點(diǎn)整合提供了分子基礎(chǔ)，與既往哺乳動物研究相比，雞胚PGCs表現(xiàn)出更高的同源重組傾向性。

值得注意的是，雙模式轉(zhuǎn)染未顯著改變表觀修飾水平（甲基化率<15%），表明該策略可規(guī)避轉(zhuǎn)基因沉默問題。未來研究需進(jìn)一步優(yōu)化納米載體粒徑，以提升其在生殖嵴微環(huán)境中的靶向性。

結(jié)論

建立了雞胚PGCs高效雙模式轉(zhuǎn)染體系，闡明電穿孔與納米載體的協(xié)同增效機(jī)制，并證實(shí)HDR通路在轉(zhuǎn)基因整合中的核心作用。該成果為禽類遺傳育種及生殖細(xì)胞基因編輯提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)

1. 慢病毒載體體外轉(zhuǎn)染雞胚原始生殖細(xì)胞 [J] . 丁紅梅 ,徐世永 ,邵根寶 . 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報 . 2007,第004期

2. 雞胚胎原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFP基因的研究 [J] . 孫鵬翔 ,陳昊 ,葛劍輝 . 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版 . 2007,第003期

3. 大分子BAC基因打靶載體轉(zhuǎn)染雞胚原始生殖細(xì)胞 [J] . 唐冬生 ,劉晉榮 ,蔣泓 . 中國組織工程研究 . 2009,第010期

4. 第28期雞胚原始生殖細(xì)胞的冷凍保存與體外培養(yǎng)研究 [J] . 肖小珺 ,蔡琳琳 ,秦潔 . 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版） . 2005,第002期

5. 17β-雌二醇對雞胚原始生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響 [J] . 潘瑩 ,劉艷艷 ,楚寧寧 . 中國畜牧獸醫(yī) . 2009,第001期

6. 雞胚原始生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的研究進(jìn)展 [C] . 鄭桂純 ,趙姝燦 ,張曉芳 . 第27屆廣東畜牧獸醫(yī)科技大會 . 2018第014期

7. 慢病毒轉(zhuǎn)染雞胚原始生殖細(xì)胞及性腺嵌合體雞的制備 [A] . 丁紅梅 . 2007第025期