摘要

分子克隆技術構建雞Bcl2基因的重組表達質粒，利用威尼德電穿孔儀轉染雞原代成纖維細胞，探究Bcl2過表達對細胞凋亡的調控作用。實驗采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot驗證Bcl2蛋白表達水平。結果顯示，轉染組細胞凋亡率顯著降低，表明Bcl2通過抑制凋亡關鍵通路發(fā)揮調控功能，為家禽抗病育種提供理論依據。

引言

Bcl2家族蛋白是細胞凋亡調控的核心因子，其中抗凋亡成員Bcl2通過抑制線粒體途徑的細胞色素C釋放，阻斷Caspase級聯(lián)反應，從而維持細胞存活。在家禽疾病模型中，Bcl2的表達水平與病毒感染或應激誘導的細胞凋亡密切相關，但其在雞細胞中的具體調控機制尚不明確。
本研究以雞Bcl2基因為靶點，構建其真核表達載體，并通過轉染技術實現(xiàn)其在雞原代細胞中的過表達。通過系統(tǒng)分析轉染后細胞的凋亡表型及分子信號變化，揭示Bcl2在雞細胞凋亡調控中的作用，為家禽抗病基因功能研究和分子育種提供實驗基礎。

實驗部分

1. 雞Bcl2基因克隆與質粒構建

（1）RNA提取與cDNA合成

取10日齡健康雞脾臟組織，采用某試劑總RNA提取試劑盒分離總RNA，使用某試劑反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性，確保A260/A280比值介于1.8-2.0。

（2）PCR擴增與載體連接

設計特異性引物（正向：5'-ATGGGCTACGAGTGGGAG-3'；反向：5'-TCACACCTGCGGCTCCAA-3'），以cDNA為模板擴增Bcl2全長編碼區(qū)。PCR反應體系含某試劑高保真酶，程序為：95℃預變性5 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1.5 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產物經某試劑純化后，利用威尼德紫外交聯(lián)儀將Bcl2片段與pcDNA3.1載體（經EcoRI/XhoI雙酶切）進行連接，構建重組質粒pcDNA3.1-Bcl2。

（3）質粒驗證與擴增

將連接產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)16 h。挑取單菌落擴增后，通過菌落PCR和雙酶切驗證陽性克隆，并通過某試劑測序服務確認序列正確性。陽性質粒經某試劑質粒大提試劑盒純化，分光光度計測定濃度為1.2 μg/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2. 細胞培養(yǎng)與轉染

（1）雞原代成纖維細胞分離

取雞胚真皮組織，剪碎后以0.25%某試劑胰酶消化30 min，經200目濾網過濾，離心收集細胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，接種于6孔板（密度為5×10^5/孔），37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%匯合。

（2）電穿孔轉染

將pcDNA3.1-Bcl2質粒與空載體對照組分別與細胞懸液混合（質粒用量2 μg/孔），轉移至威尼德電穿孔儀專用電擊杯中，設置參數：電壓200 V、脈沖時間10 ms、電容950 μF。電擊后立即加入預溫培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

3. 細胞凋亡檢測與分子機制分析

（1）流式細胞術檢測凋亡率

收集轉染48 h的細胞，以某試劑Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒處理，避光孵育15 min。采用某品牌流式細胞儀檢測，設置激發(fā)波長488 nm，分析早期凋亡（Annexin V+/PI-）與晚期凋亡（Annexin V+/PI+）細胞比例。

（2）Western blot驗證Bcl2及凋亡相關蛋白

裂解細胞提取總蛋白，BCA法測定濃度。取30 μg蛋白經SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。依次加入兔抗雞Bcl2單抗（1:1000）、鼠抗Caspase-3單抗（1:2000）及β-actin內參抗體（1:5000），4℃孵育過夜。TBST洗滌后，加入HRP標記二抗（1:5000），室溫孵育1 h。使用威尼德分子雜交儀進行ECL顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

（3）線粒體膜電位檢測

采用某試劑JC-1熒光探針，負載細胞后37℃避光孵育20 min。熒光顯微鏡下觀察紅/綠熒光比值變化，比值降低表明線粒體膜電位下降。

結果與討論

1. 質粒構建與轉染效率

雙酶切及測序證實pcDNA3.1-Bcl2構建成功。流式細胞術顯示，電穿孔轉染效率達65%±3.2%。

2. Bcl2過表達抑制細胞凋亡

轉染組凋亡率為12.4%±1.8%，顯著低于對照組（28.7%±2.5%，*P<0.01）。Western blot顯示Bcl2蛋白表達量上調3.5倍，同時活性Caspase-3水平下降60%。

3. 線粒體途徑調控機制

JC-1檢測顯示，Bcl2過表達細胞線粒體膜電位維持穩(wěn)定（紅/綠熒光比值1.8±0.2），而對照組比值降至0.6±0.1，表明Bcl2通過保護線粒體完整性抑制Caspase活化。

結論

雞Bcl2真核表達質粒，證實其過表達可通過穩(wěn)定線粒體膜電位、抑制Caspase-3活化顯著降低細胞凋亡率。該發(fā)現(xiàn)為解析家禽抗凋亡分子機制及抗病品種選育提供了重要實驗依據。

實驗儀器與試劑

1. 威尼德電穿孔儀

2. 威尼德紫外交聯(lián)儀

3. 某試劑流式細胞儀

4. 某試劑Western blot相關試劑（一抗、二抗、ECL底物）

參考文獻

1. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis.[J].D M; Hockenbery;Z N; Oltvai;X M; Yin;C L; Milliman;S J; Korsmeyer,Cell.1993,第2期

2. Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells.[J].D L; Vaux;S; Cory;J M; Adams,Nature.1988,第5期

3. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death.[J].Z N; Oltvai;C L; Milliman;S J; Korsmeyer,Cell.1993,第9期

4. Bcl-2 inhibition of neural death: decreased generation of reactive oxygen species.[J].D J; Kane;T A; Sarafian;R; Anton;H; Hahn;E B; Gralla;J S; Valentine;T; Ord;D E; Bredesen,Science (New York, N.Y.).1993,第6期

5. Cloning and sequencing of a cDNA encoding the rat Bcl-2 protein[J].Takaaki Sato;Shinji Irie;Stanislaw Krajewski;John C. Reed,Gene.1994,第2期

6. Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma[J].Y Tsujimoto;J Cossman;E Jaffe;CM Croce,科學（上海）.1985,第4706期