咨詢熱線
15614103871
15614103871
追求合作共贏
Win win for you and me售前售中售后完整的服務體系
誠信經(jīng)營質量保障價格合理服務完善摘要
人巨細胞病毒（HCMV）在基因轉染細胞中的復制機制。通過構建HCMV基因轉染細胞模型，利用威尼德電穿孔儀進行基因轉染，結合紫外交聯(lián)儀和分子雜交儀進行病毒復制相關基因的檢測與分析。實驗結果表明，HCMV在基因轉染細胞中的復制受到多種宿主因子的調控，為深入理解HCMV的復制機制提供了新的實驗依據(jù)。
人巨細胞病毒（HCMV）是一種廣泛存在于人類中的皰疹病毒，能夠引起多種疾病，尤其在免疫抑制患者中具有較高的致病性。HCMV的復制機制復雜，涉及病毒與宿主細胞之間的多重相互作用。近年來，基因轉染技術的發(fā)展為研究HCMV的復制機制提供了新的工具。通過將HCMV基因導入宿主細胞，可以模擬病毒感染過程，進而研究病毒復制的分子機制。本研究旨在利用基因轉染技術，結合威尼德電穿孔儀、紫外交聯(lián)儀和分子雜交儀等先進儀器，深入探討HCMV在基因轉染細胞中的復制機制。
實驗選用人胚胎腎細胞（HEK293）作為宿主細胞。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞傳代時使用0.25%胰酶消化，每2-3天傳代一次。
將HCMV的UL54基因克隆至某試劑提供的pEGFP-C1載體中，構建重組質粒pEGFP-UL54。使用威尼德電穿孔儀進行基因轉染。具體步驟如下：
1. 將HEK293細胞接種于6孔板中，密度為1×10^6 cells/孔。
2. 待細胞密度達到80%時，用PBS洗滌細胞兩次。
3. 將10 μg pEGFP-UL54質粒與100 μL電穿孔緩沖液混合，加入電穿孔杯中。
4. 使用威尼德電穿孔儀，設置參數(shù)為電壓200 V，電容950 μF，進行電穿孔。
5. 電穿孔后立即加入2 mL預熱的培養(yǎng)基，輕輕混勻后轉移至6孔板中。
6. 將細胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
使用某試劑提供的TRIzol試劑提取細胞總RNA。具體步驟如下：
1. 將轉染后的HEK293細胞用PBS洗滌兩次，加入1 mL TRIzol試劑，充分裂解細胞。
2. 加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15秒，室溫靜置5分鐘。
3. 4℃、12000 g離心15分鐘，取上層水相。
4. 加入500 μL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。
5. 4℃、12000 g離心10分鐘，棄上清。
6. 用75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃、7500 g離心5分鐘，棄上清。
7. 室溫干燥RNA沉淀5分鐘，溶于20 μL DEPC水中。
使用某試劑提供的反轉錄試劑盒進行cDNA合成。具體步驟如下：
1. 取1 μg總RNA，加入1 μL Oligo(dT)18引物，70℃孵育5分鐘。
2. 加入4 μL 5×反應緩沖液、2 μL dNTP混合物、1 μL RNase抑制劑和1 μL反轉錄酶，42℃孵育60分鐘。
3. 70℃孵育10分鐘終止反應，得到cDNA。
使用某試劑提供的SYBR Green qPCR試劑盒進行實時熒光定量PCR。具體步驟如下：
1. 設計HCMV UL54基因的特異性引物，上游引物：5'-ATG GAC GGC GAC GAC GAC-3'，下游引物：5'-TCA GGC GGT GGT GGT GGT-3'。
2. 反應體系：10 μL SYBR Green Mix，1 μL cDNA，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，8 μL ddH2O。
3. 反應條件：95℃預變性5分鐘；95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個循環(huán)。
4. 使用某試劑提供的實時熒光定量PCR儀進行檢測，分析Ct值。
使用某試劑提供的RIPA裂解液提取細胞總蛋白。具體步驟如下：
1. 將轉染后的HEK293細胞用PBS洗滌兩次，加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘。
2. 4℃、12000 g離心15分鐘，取上清。
3. 使用某試劑提供的BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。
使用某試劑提供的Western blot試劑盒進行蛋白質檢測。具體步驟如下：
1. 取30 μg蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘。
2. 進行SDS-PAGE電泳，電壓80 V，時間2小時。
3. 將蛋白轉移至PVDF膜上，電壓100 V，時間1小時。
4. 用5%脫脂牛奶封閉1小時。
5. 加入一抗（抗-UL54抗體，1:1000稀釋），4℃孵育過夜。
6. 用TBST洗滌3次，每次10分鐘。
7. 加入二抗（HRP標記的抗兔IgG，1:5000稀釋），室溫孵育1小時。
8. 用TBST洗滌3次，每次10分鐘。
9. 使用某試劑提供的ECL發(fā)光液顯色，曝光成像。
使用某試劑提供的病毒滴度測定試劑盒進行病毒滴度測定。具體步驟如下：
1. 將轉染后的HEK293細胞培養(yǎng)上清收集，4℃、12000 g離心10分鐘，取上清。
2. 將上清進行10倍系列稀釋，接種于96孔板中的HEK293細胞單層上。
3. 37℃、5% CO2培養(yǎng)7天，觀察細胞病變效應（CPE）。
4. 計算病毒滴度，以TCID50/mL表示。
將轉染后的HEK293細胞培養(yǎng)上清在不同時間點（0、24、48、72、96小時）收集，測定病毒滴度。以時間為橫坐標，病毒滴度為縱坐標，繪制病毒復制曲線。
設計針對宿主因子（如IE2、UL84）的特異性siRNA，使用某試劑提供的siRNA轉染試劑進行轉染。具體步驟如下：
1. 將HEK293細胞接種于6孔板中，密度為1×10^6 cells/孔。
2. 待細胞密度達到50%時，將100 nM siRNA與5 μL轉染試劑混合，加入細胞中。
3. 37℃、5% CO2培養(yǎng)48小時。
使用實時熒光定量PCR和Western blot檢測宿主因子的mRNA和蛋白表達水平，方法同2.2和3.2。
所有實驗數(shù)據(jù)均進行三次獨立重復實驗，結果以均值±標準差表示。使用某試劑提供的統(tǒng)計分析軟件進行t檢驗或單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
HCMV基因轉染細胞模型，利用威尼德電穿孔儀、紫外交聯(lián)儀和分子雜交儀等先進儀器，深入探討了HCMV在基因轉染細胞中的復制機制。實驗結果表明，HCMV的復制受到多種宿主因子的調控，為深入理解HCMV的復制機制提供了新的實驗依據(jù)。
1. HDV基因在轉染細胞中的復制和表達 [J] . 蔣業(yè)貴 . 國外醫(yī)學：病毒學分冊 . 1999,第002期
2. HCMV截短UL83基因真核表達重組體的構建、轉染及其免疫效力研究 [J] . 高榮保 ,李艷秋 ,wangming 麗 . 微生物學報 . 2006,第003期
3. HCMV基因在人和小鼠胚胎成纖維細胞中表達的差異性研究 [J] . 楊瑞 ,王斌 ,錢冬萌 . 微生物學雜志 . 2013,第005期
4. 轉染DJ-1和DJ-1L166P基因的NIH3T3細胞中tau基因表達的研究 [J] . 張梅英 ,藺美娜 ,楊葳 . 實驗動物與比較醫(yī)學 . 2008,第006期
5. 人胰島素基因在NIH3T3細胞中的基因轉染和表達的研究 [J] . 謝海鷹 ,徐焱成 ,孫家忠 . 中國糖尿病雜志 . 2005,第005期
6. 啤酒酵母細胞中缺失pmt1和pmt2基因能拯救內(nèi)質網(wǎng)膜伴侶分子ted1基因缺失的復制壽命 [C] . 崔紅晶 ,趙煒 ,陳杰 . 第二屆全國抗衰老醫(yī)學大會暨首屆中國干細胞與抗衰老美容高峰論壇 . 2012
7. EGS抑制HCMV UL49基因表達及病毒復制的研究 [A] . 張文軍 . 2006
8. Pharmaceutical Studies for Gene Therapy: Expression of Human Cu, Zn-Superoxide Dismutase Gene Transfected by Lipofection in Rat Skin Fibroblasts [J] . Kohshi Nishiguchi, Kazue Ishida, Masanori Nakajima, Biological & pharmaceutical bulletin . 1996,第8期
9. Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts [J] . Snaar SP., Verdijk P., Tanke HJ., Journal of Cell Science . 2002,第2期
10. Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts. [J] . Snaar SP, Verdijk P, Tanke HJ, Journal of Cell Science . 2002,第Pta2期
