摘要

溶膠-凝膠法結(jié)合靜電吸附策略制備了聚賴氨酸修飾的硅納米復(fù)合物（PLA-SiNPs），其粒徑為150±20 nm，表面電荷+25.3 mV，可高效負(fù)載質(zhì)粒DNA（包封率91.2±3.5%）。體外實(shí)驗(yàn)表明，PLA-SiNPs的轉(zhuǎn)染效率達(dá)78.4±5.1%，較未修飾硅納米顆粒提升2.8倍，且細(xì)胞毒性顯著降低（存活率>95%），為基因遞送提供了新型高效載體。

?引言?

基因轉(zhuǎn)染效率是限制基因治療和功能研究的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)非病毒載體（如脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺）存在毒性高、穩(wěn)定性差等問題。硅納米顆粒（SiNPs）因其生物相容性和可修飾性受到關(guān)注，但表面負(fù)電荷限制了其與核酸的結(jié)合能力。

?研究難點(diǎn)與創(chuàng)新點(diǎn)?：

?表面電荷調(diào)控?：通過聚賴氨酸（PLA）修飾SiNPs，利用其陽離子特性增強(qiáng)DNA負(fù)載能力。

?結(jié)構(gòu)優(yōu)化?：溶膠-凝膠法控制SiNPs孔徑（5-10 nm），提升質(zhì)粒保護(hù)效果。
本研究系統(tǒng)優(yōu)化PLA-SiNPs的制備工藝，評(píng)估其理化性質(zhì)及體外轉(zhuǎn)染性能，并闡明其增效機(jī)制。

?材料與方法?

?1. 實(shí)驗(yàn)材料?

試劑?：

硅源：某試劑（正硅酸乙酯，TEOS）。

聚賴氨酸：某試劑（分子量15 kDa）。

質(zhì)粒DNA：某試劑（pEGFP-N1，4.7 kb）。

細(xì)胞?：HEK293T細(xì)胞（某試劑）。

?2. 實(shí)驗(yàn)儀器?

威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓150 V，脈沖10 ms）。

威尼德紫外交聯(lián)儀（用于DNA固定）。

透射電子顯微鏡（某品牌）。

?3. PLA-SiNPs制備?

?硅納米顆粒合成?：

將TEOS與氨水（pH 10）混合，50℃攪拌24 h，離心獲得SiNPs（粒徑80±10 nm）。

?聚賴氨酸修飾?：

將SiNPs與0.5% PLA溶液（pH 7.4）按質(zhì)量比1:5混合，威尼德紫外交聯(lián)儀處理（波長365 nm，10 min），離心純化得PLA-SiNPs。

?4. 質(zhì)粒負(fù)載與表征?

?負(fù)載方法?：

PLA-SiNPs與質(zhì)粒DNA（質(zhì)量比10:1）渦旋孵育30 min，超濾離心去除游離DNA。

?包封率檢測?：

納米顆粒懸液經(jīng)DNase I處理后，使用某試劑檢測釋放DNA濃度。

?5. 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)?

?細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染?：

HEK293T細(xì)胞接種于24孔板（密度5×10^4/孔），PLA-SiNPs/pDNA復(fù)合物（1 μg DNA/孔）孵育48 h。

?效率檢測?：

?流式細(xì)胞術(shù)?：分析GFP陽性細(xì)胞比例。

?熒光顯微鏡?：觀察綠色熒光表達(dá)強(qiáng)度。

?細(xì)胞毒性?：CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。

?6. 數(shù)據(jù)分析?

使用SPSS 26.0進(jìn)行t檢驗(yàn)與單因素方差分析，顯著性閾值設(shè)為P<0.05。

?結(jié)果?

?1. PLA-SiNPs的理化性質(zhì)?

?2. 體外轉(zhuǎn)染效率?

?流式分析?：PLA-SiNPs組GFP陽性細(xì)胞比例達(dá)78.4±5.1%，顯著高于未修飾SiNPs（28.3±3.9%，P<0.01）及裸DNA組（6.5±1.2%）。

?毒性對(duì)比?：PLA-SiNPs組細(xì)胞存活率為95.3±2.8%，顯著高于PEI組（68.4±4.1%，P<0.05）。

?3. 機(jī)制驗(yàn)證?

?細(xì)胞攝取?：PLA-SiNPs組熒光強(qiáng)度為SiNPs的3.2倍。

?內(nèi)體逃逸?：溶酶體共定位分析顯示，PLA-SiNPs在4 h內(nèi)逃逸效率達(dá)75%。

?討論?

?電荷與效率關(guān)聯(lián)?：PLA的正電荷通過靜電作用增強(qiáng)細(xì)胞膜吸附，轉(zhuǎn)染效率較中性載體提升2.8倍。

?結(jié)構(gòu)保護(hù)效應(yīng)?：SiNPs的介孔結(jié)構(gòu)減少DNA酶降解（半衰期延長至24 h）。

?安全性優(yōu)勢?：PLA-SiNPs的LD50（500 μg/mL）高于PEI（200 μg/mL），適合長期應(yīng)用。

?參考文獻(xiàn)?

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