摘要：本研究聚焦黑曲霉菌 pyrG 基因。闡述其在黑曲霉研究中的重要性，詳細介紹 pyrG 基因克隆流程，包括引物設計、模板獲取、PCR 擴增等，以及同源轉化過程中載體構建、原生質體制備與轉化方法，為深入探究黑曲霉基因功能與遺傳改良提供技術支撐。
黑曲霉是一種廣泛存在且具有重要工業應用價值的絲狀真菌。它在食品發酵、酶生產、生物制藥等多個領域發揮著關鍵作用。pyrG 基因編碼乳清酸核苷酸脫羧酶，該酶在嘧啶核苷酸合成途徑中占據核心地位。對黑曲霉菌 pyrG 基因進行克隆與同源轉化研究，有助于深入理解黑曲霉的遺傳信息傳遞、代謝調控機制以及為其遺傳改造提供精準的技術手段。通過精確調控 pyrG 基因，可以實現對黑曲霉生長特性、代謝產物合成等多方面的人為干預，從而推動相關工業領域的技術革新與發展。
黑曲霉菌株與培養條件
pyrG 基因克隆
引物設計：基于黑曲霉已知的基因組序列信息，利用專業的生物信息學軟件設計針對 pyrG 基因的特異性引物。引物的設計遵循引物長度適宜（一般 18 - 25bp）、GC 含量適中（40% - 60%）、避免二級結構形成以及在基因序列上具有特異性結合位點等原則。設計完成后，對引物進行合成并通過高效液相色譜法進行純化，以保證引物的純度和質量。
基因組 DNA 提取：采用改良的 CTAB 法提取黑曲霉基因組 DNA。首先，收集適量的黑曲霉菌絲體，在液氮中研磨成細粉，迅速轉移至含有 CTAB 裂解緩沖液的離心管中。接著，在 65°C 水浴中孵育一段時間，期間適時輕柔混勻。然后，加入等體積的氯仿 / 異戊醇混合液，充分振蕩混勻后離心，取上清液。重復氯仿 / 異戊醇抽提步驟以進一步純化 DNA。最后，加入異丙醇沉淀 DNA，用 70% 乙醇洗滌沉淀，干燥后溶于適量的 TE 緩沖液中。通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測 DNA 的完整性和濃度。
PCR 擴增：以提取的黑曲霉基因組 DNA 為模板，加入設計好的特異性引物、高保真 DNA 聚合酶、dNTPs 以及相應的 PCR 緩沖液，在 PCR 儀中進行擴增反應。反應條件經過優化，包括預變性溫度（如 95°C，5min）、變性溫度（95°C，30s）、退火溫度（根據引物 Tm 值確定，一般 55 - 60°C，30s）、延伸溫度（72°C，根據目的基因長度確定延伸時間，一般 1 - 2min/kb）以及循環次數（一般 30 - 35 個循環）。擴增結束后，取部分 PCR 產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，觀察是否有預期大小的條帶出現。
同源轉化載體構建
黑曲霉原生質體制備與轉化
原生質體制備：收集處于對數生長期的黑曲霉菌絲體，用適當濃度的滲透壓穩定劑（如 1.2M 山梨醇溶液）洗滌菌絲體。然后，加入含有特定細胞壁水解酶（如蝸牛酶、纖維素酶等混合酶液）的消化液，在適宜的溫度（如 30°C）和振蕩條件下進行細胞壁消化反應。每隔一段時間取樣，在顯微鏡下觀察原生質體的釋放情況。當原生質體釋放量達到一定比例時，通過過濾除去未消化的菌絲體殘渣，再用滲透壓穩定劑洗滌原生質體，最后將原生質體懸浮于適量的 STC 緩沖液中，調整原生質體濃度至合適范圍（如 1×10? - 1×10?/ml）。
轉化反應：將構建好的同源轉化載體與適量的黑曲霉原生質體混合均勻，加入 PEG 介導轉化溶液，在冰上孵育一段時間（如 20 - 30min），然后迅速轉移至 42°C 水浴中熱激一定時間（如 5min）。熱激結束后，迅速冷卻至冰浴，加入適量的預冷的 STC 緩沖液和再生培養基，混勻后涂布于含有特定篩選劑（根據載體上的篩選標記基因確定，如潮霉素 B）的再生平板上。在適宜的培養條件下培養一段時間后，觀察轉化子的生長情況并進行篩選鑒定。
pyrG 基因克隆結果
同源轉化載體構建驗證
原生質體制備與轉化效果
本研究成功地完成了黑曲霉菌 pyrG 基因的克隆與同源轉化。通過優化實驗流程中的各個環節，包括基因克隆過程中的引物設計、PCR 擴增條件，同源轉化載體構建的酶切連接步驟以及原生質體制備與轉化的條件控制等，建立了一套較為完善的黑曲霉菌 pyrG 基因克隆與同源轉化技術體系。該體系為深入研究黑曲霉 pyrG 基因的功能，如對嘧啶核苷酸合成代謝的調控機制，以及通過對 pyrG 基因的進一步操作實現黑曲霉的定向遺傳改良提供了堅實的技術基礎。在未來的研究中，可以進一步探索 pyrG 基因與其他基因之間的相互作用網絡，研究其在不同環境條件下的表達調控模式，并且利用該同源轉化技術平臺構建更多具有特殊性狀的黑曲霉工程菌株，以滿足食品、醫藥、工業酶生產等領域不斷增長的需求。
