外源基因轉染細胞技術作為現(xiàn)代生物學與醫(yī)學研究的關鍵工具，歷經(jīng)多年發(fā)展取得了豐碩成果。本綜述系統(tǒng)闡述了該技術的研究現(xiàn)狀，涵蓋物理、化學、生物三大類轉染方法，深入剖析各類方法的原理、優(yōu)勢與局限性；詳細探討轉染效率、細胞毒性、基因表達穩(wěn)定性等核心評價指標；并聚焦新興技術如納米材料介導、CRISPR-Cas 系統(tǒng)輔助轉染的前沿進展。旨在為科研人員精準選擇適配的轉染策略、攻克現(xiàn)存技術瓶頸，及推動跨學科研究應用提供全面、前沿且具深度的專業(yè)參考。

在生命科學蓬勃發(fā)展的當下，探究基因功能、構建疾病模型、研發(fā)基因治療方案等諸多關鍵研究領域，均離不開外源基因轉染細胞技術。這一技術宛如一座橋梁，跨越了外源遺傳物質與靶細胞之間的天然屏障，使得人為操控細胞基因表達成為可能，進而解鎖眾多生命奧秘，為攻克疑難病癥開辟嶄新路徑。

自上世紀 70 年代基因轉染技術雛形初現(xiàn)，歷經(jīng)數(shù)十年探索，科研人員從早期借助病毒天然感染機制，逐步拓展至融合物理學、化學多學科原理創(chuàng)新轉染手段，成果斐然卻也挑戰(zhàn)重重。當下，如何在確保高效轉染的同時降低細胞毒性、精準調控轉染后基因表達時空特性，依舊是亟待攻克的前沿課題。本文將全方面梳理外源基因轉染細胞技術的發(fā)展脈絡、詳述主流技術細節(jié)、剖析前沿突破，以期為學界同仁呈上一份詳實且具啟發(fā)性的技術指南。

電穿孔技術基于細胞膜在高強度電場作用下瞬間形成可逆性微孔這一更好電學特性。當向細胞懸液施加特定脈沖電場，通常電場強度維持在 100 - 1000 V/cm、脈沖持續(xù)時間為微秒至毫秒級，細胞膜磷脂雙分子層結構紊亂，孔隙應運而生，外源 DNA、RNA 等遺傳物質順勢經(jīng)孔隙擴散入胞內(nèi)。

在實驗操作層面，科研人員先將靶細胞輕柔重懸于預冷的電轉緩沖液，緩沖液成分經(jīng)精細調配以維持細胞滲透壓與離子穩(wěn)態(tài)；精準調控細胞密度至適宜范圍，一般哺乳動物細胞濃度為 1×10? - 1×10? 個 /mL。隨后按一定比例混入待轉染核酸，轉移至特制電轉杯，安置于電穿孔儀電極間。依細胞類型差異微調電穿孔參數(shù)，例如轉染小鼠胚胎干細胞，電場強度設為 800 V/cm、脈沖時長 30 ms，重復電擊 2 - 3 次，確保核酸足量攝入細胞，操作全程嚴格把控溫度、避免氣泡生成，以防細胞受損。

顯微注射堪稱細胞基因轉染領域的 “精密外科手術"。在高倍倒置顯微鏡輔助下，借助纖細玻璃微針（直徑常小于 1 μm），研究人員手動將外源基因溶液精準注入單個細胞胞質或細胞核。這一技術優(yōu)勢顯著，轉染物質劑量精準可控，近乎無核酸降解風險，基因遞送效率出眾；然而技術門檻頗高，對操作人員熟練度、儀器精密度要求苛刻，通量極低，僅適用于少量珍貴細胞樣本，如胚胎干細胞早期發(fā)育研究、轉基因動物模型構建初期細胞操作。

實際操作時，需先運用拉針儀精心制備微針，經(jīng)煅燒、打磨確保針尖順滑銳利；固定細胞于顯微操作臺上，借助負壓輕柔吸附細胞，操控微針緩慢刺入預定細胞區(qū)室，以皮升級微量注射器精準推送核酸溶液，注射體積常嚴控在 1 - 10 pL，過程需全程監(jiān)測細胞形態(tài)，損傷引發(fā)細胞裂解。

脂質體轉染是實驗室應用最為廣泛的化學轉染手段之一，核心原理是陽離子脂質體與帶負電核酸分子借靜電引力自發(fā)組裝成復合物。陽離子脂質頭部親和核酸磷酸基團，疏水尾部相互靠攏，包裹核酸形成納米級脂質微粒；該微粒憑借脂質成分與細胞膜脂質相似相溶特性，融合細胞膜，將核酸釋放至胞內(nèi)。

實驗流程起始于脂質體與核酸按特定質量比（依細胞、核酸種類微調，常見 1:1 - 3:1）室溫孵育 15 - 30 分鐘，促使復合物穩(wěn)定成型；轉染前細胞換用無血清培養(yǎng)基，旨在降低血清蛋白對外源復合物干擾；輕柔滴加復合物至細胞培養(yǎng)皿，置于 37°C、5% CO?孵箱孵育 2 - 6 小時后，補加含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以人腎上皮細胞 HEK293T 轉染熒光報告基因實驗為例，脂質體 2000 與質粒 DNA 按 2:1 配比，轉染 4 小時后熒光顯微鏡下可見顯著綠色熒光蛋白表達，轉染效率超 50%，但部分細胞因脂質累積現(xiàn)輕微毒性表征。

磷酸鈣共沉淀法巧妙利用了磷酸鈣在生理條件下形成沉淀裹挾核酸沉淀至細胞表面，借細胞內(nèi)吞機制攝取外源基因。實驗時，將氯化鈣溶液與含核酸磷酸緩沖液緩慢混合，在特定 pH（約 7.0 - 7.4）、溫度（室溫至 37°C）條件下孵育，促使細微磷酸鈣 - 核酸共沉淀析出；均勻滴加至細胞層，孵育數(shù)小時后細胞經(jīng)內(nèi)吞攝取沉淀微粒實現(xiàn)轉染。

如在小鼠成纖維細胞 NIH3T3 轉染實驗中，先配置 25 mM 氯化鈣、2X HBS（ Hepes 緩沖鹽水），將 1 - 10 μg 質粒 DNA 混入氯化鈣溶液，逐滴加至等體積 2X HBS，渦旋混勻、室溫靜置 30 分鐘形成沉淀懸液；輕柔覆蓋細胞，37°C 孵育 4 - 6 小時，換液培養(yǎng) 24 - 48 小時后檢測基因表達，轉染效率約 30%，成本低廉，但沉淀顆粒不均一、重復性欠佳，易致細胞應激損傷。

病毒載體轉染是基因治療臨床前研究與部分臨床試驗階段倚重的高效策略。逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒等經(jīng)基因工程改造，剔除致病基因，保留感染、整合宿主細胞基因組能力，將外源治療基因精準輸送、整合入靶細胞染色體特定區(qū)域。

以慢病毒載體構建及轉染造血干細胞為例，科研人員先克隆目標基因至慢病毒穿梭質粒，與包裝質粒共轉染 293T 細胞，48 - 72 小時后收集富含重組慢病毒上清液；超速離心濃縮、過濾除菌；將造血干細胞與病毒液按感染復數(shù)（MOI）10 - 50 孵育 6 - 12 小時，借熒光標記基因監(jiān)測轉染效率高達 80% 以上，基因長期穩(wěn)定表達，但病毒載體免疫原性、潛在致瘤風險是臨床轉化掣肘難題。

轉染效率直觀反映外源基因成功導入細胞的比例，關乎實驗成敗。常用檢測手段涵蓋熒光顯微鏡直接觀測熒光蛋白表達、流式細胞術精準定量熒光陽性細胞比率、定量 PCR 測定轉染細胞內(nèi)目的基因拷貝數(shù)等。不同檢測各有優(yōu)劣，熒光顯微鏡簡便直觀卻易受主觀判斷干擾；流式細胞術通量高、精度準，但儀器昂貴、樣本處理繁瑣；定量 PCR 靈敏度超群，可精準量化基因拷貝，卻對樣本純度、操作規(guī)范性要求嚴苛。

細胞毒性評估旨在監(jiān)測轉染流程對細胞生理機能損害程度，關乎細胞存活、增殖及后續(xù)實驗數(shù)據(jù)可靠性。乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗借檢測細胞受損后胞內(nèi) LDH 逸出量評估膜完整性；MTT、CCK - 8 比色法通過活細胞代謝還原試劑顯色深淺量化細胞活性；顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，如胞體腫脹、膜泡形成、核固縮等異常表征輔助判斷毒性強弱。理想轉染應在保障高效基因遞送同時，將細胞毒性控制在低限度。

基因轉染后持續(xù)、穩(wěn)定表達是眾多長期研究訴求，尤其在基因治療領域。借助 Western blot 監(jiān)測目的蛋白表達量動態(tài)變化、熒光素酶報告基因系統(tǒng)實時追蹤基因轉錄活性，科研人員可洞悉轉染基因表達時效特征；基因組 DNA 測序、Southern blot 則用于剖析外源基因整合位點、拷貝數(shù)變異，闡釋表達穩(wěn)定性分子機制，為優(yōu)化轉染策略夯實數(shù)據(jù)根基。

納米材料家族如金納米粒子、碳納米管、量子點衍生納米復合物，為基因轉染注入全新活力。這些納米級載體粒徑精準可控，表面經(jīng)功能基團修飾后親和核酸、靶向細胞特異性受體，實現(xiàn)高效、低毒基因轉運。

研究團隊創(chuàng)新性合成聚乙二醇修飾金納米棒 - 核酸復合物，金納米棒更好光學特性利于實時示蹤轉染路徑；表面 PEG 鏈屏蔽免疫識別、降低非特異性吸附，體內(nèi)外實驗顯示，轉染肝癌細胞效率較傳統(tǒng)脂質體提升 30%，細胞毒性削減 50%，彰顯納米材料在腫瘤基因治療精準遞送層面巨大潛力。

CRISPR - Cas 基因編輯技術與轉染技術深度融合，革新基因功能研究范式。科研人員借 CRISPR - Cas9 系統(tǒng)搭載 sgRNA 及外源修復模板轉染細胞，精準敲除、插入或修復靶基因，實現(xiàn)基因原位編輯；基于 Cas13 蛋白靶向 RNA 切割活性，拓展至 RNA 編輯、調控領域。

在杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）細胞模型構建中，將編碼 Cas9、sgRNA 及正常 dystrophin 基因 cDNA 質粒共轉染患者來源肌細胞，經(jīng)篩選鑒定，成功修復致病基因突變、恢復肌蛋白表達，為遺傳性疾病基因治療勾勒希望曙光。

外源基因轉染技術雖成果斐然，但前路漫漫。如何跨越不同細胞類型固有轉染壁壘，開發(fā)普適、高效轉染試劑仍是難題；降低病毒載體免疫副反應、提升納米載體生物安全性與代謝穩(wěn)定性，亟待材料學、醫(yī)學多學科協(xié)同破局；轉染后基因表達精準時空調控，契合生理病理進程需求，呼喚合成生物學深度介入。

展望未來，隨著單細胞測序、人工智能輔助藥物設計蓬勃興起，外源基因轉染技術有望迎來個性化定制時代。借助大數(shù)據(jù)精準解析細胞異質性，人工智能模擬優(yōu)化轉染方案，靶向遞送基因、智能調控表達將不再遙遠，解鎖更多生命科學未知疆域，托舉基因治療臨床轉化愿景落地。

綜上，外源基因轉染細胞技術作為生命科學研究基石，正歷經(jīng)持續(xù)蛻變，從基礎原理深耕至前沿應用拓展，每一次技術革新都為學界注入前行動力，激勵科研人員勇攀生命密碼解析高峰，推動生物醫(yī)學闊步邁向精準、治愈新紀元。