一、引言

染色體異常是導致胎兒先天畸形、智力低下、發育遲緩等多種不良妊娠結局的重要原因之一。產前診斷對于發現染色體異常胎兒，為家庭和臨床提供決策依據具有至關重要的作用。傳統的染色體核型分析是產前診斷的金標準，但該方法存在操作復雜、耗時長（一般需要數天至數周）等缺點，尤其是對于急需診斷結果的孕婦（如孕周較大等情況）并不十分理想。

熒光原位雜交（FISH）技術作為一種分子細胞遺傳學技術，具有快速、靈敏、特異性高的特點，能夠在較短時間內對羊水細胞中的特定染色體異常進行檢測。它可以檢測染色體的數目異常，如 21 - 三體、18 - 三體、13 - 三體等，以及部分染色體結構異常。近年來，FISH 技術在產前診斷領域得到了廣泛應用，為染色體異常的早期診斷提供了一種有效的手段，大大提高了產前診斷的效率和質量。

二、熒光原位雜交技術原理

FISH 技術是基于核酸分子雜交原理。它利用已知序列的熒光標記核酸探針與細胞內的染色體 DNA 進行特異性雜交。這些探針可以特異性地識別染色體上特定的基因序列或區域。當探針與目標 DNA 序列互補結合后，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光信號。通過對熒光信號的數量、位置和分布等特征的分析，可以判斷染色體的數目和結構是否正常。

例如，對于檢測 21 - 三體綜合征，可以使用針對 21 號染色體特異性的探針。正常細胞中，在熒光顯微鏡下會觀察到兩個特定的熒光信號（對應兩條 21 號染色體），而如果是 21 - 三體細胞，則會觀察到三個熒光信號。

三、實驗材料與方法

（一）羊水樣本采集

羊水樣本一般在孕中期（16 - 22 周）通過羊膜腔穿刺術獲取。在超聲引導下，將穿刺針經腹壁、子宮壁刺入羊膜腔，抽取一定量（一般 10 - 20ml）的羊水。采集過程中要嚴格遵循無菌操作原則，以防止感染。采集后的羊水應立即送檢，避免長時間放置導致細胞活性降低。

（二）羊水細胞處理

1. 離心分離
將采集到的羊水樣本在低溫離心機中以適當的轉速（如 1000 - 1500rpm）離心 10 - 15 分鐘，使羊水細胞沉淀在離心管底部。

2. 細胞培養（可選）
對于需要進一步培養以獲得更多細胞的情況，可以將沉淀的羊水細胞接種到特定的培養基中，在合適的培養條件（37℃、5% CO?）下培養數天。培養后的細胞可以獲得更好的細胞形態和更多的染色體信息，但這會增加診斷時間。在一些緊急情況下，可以直接使用未經培養的羊水細胞進行 FISH 檢測。

3. 細胞固定
無論是培養后的細胞還是直接離心獲得的細胞，都需要進行固定處理。常用的固定劑為甲醇 - 冰醋酸（3:1）混合液。將細胞懸浮在固定劑中，反復固定幾次，以保證細胞結構完整，染色體形態清晰，便于后續雜交操作。

（三）探針選擇與標記

1. 探針類型
根據需要檢測的染色體異常類型選擇合適的探針。常見的探針包括染色體著絲粒探針、染色體特異性位點探針和全染色體涂抹探針等。例如，對于常見的三體綜合征診斷，常使用著絲粒探針。對于檢測染色體易位等結構異常，可以使用特異性位點探針或全染色體涂抹探針。

2. 探針標記
探針標記有直接標記和間接標記兩種方式。直接標記是將熒光素（如 FITC、Cy3、Cy5 等）直接連接到探針上。間接標記則是先將生物素等標記物連接到探針上，然后在雜交后通過與熒光標記的親和物質（如熒光標記的抗生物素抗體或抗抗體）反應來顯示熒光信號。直接標記操作相對簡單，而間接標記可以通過信號放大提高檢測靈敏度。

（四）雜交過程

1. 預處理
將固定好的羊水細胞涂片或滴片在適當的預處理液（如 70% 甲酰胺 / 2×SSC）中處理，使染色體 DNA 變性，成為單鏈狀態，便于與探針雜交。處理溫度和時間需要嚴格控制，一般在 70 - 75℃處理數分鐘。

2. 雜交反應
將標記好的探針與預處理后的羊水細胞樣本混合，滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在合適的雜交溫度（一般 37℃）下進行雜交反應。雜交反應時間根據探針類型和長度不同而有所差異，一般需要數小時至過夜。在雜交過程中，探針與染色體上的目標 DNA 序列特異性結合。

（五）檢測與結果分析

1. 洗滌
雜交完成后，需要進行嚴格的洗滌步驟，以去除未結合的探針。洗滌液一般采用不同濃度的 SSC 溶液和吐溫 - 20。通過逐步降低鹽濃度和溫和的洗滌劑作用，將非特異性結合的探針洗脫，而保留特異性結合的探針。

2. 熒光顯微鏡觀察
將洗滌后的載玻片在熒光顯微鏡下觀察。使用合適的濾光片來激發和檢測不同熒光標記的信號。觀察細胞內熒光信號的數量、位置和形態。對于染色體數目異常的診斷，根據特定染色體探針的熒光信號數量進行判斷。例如，正常細胞中針對某條染色體的兩個熒光信號，若出現三個或更多，則提示該染色體數目異常。對于結構異常，觀察熒光信號的分布和形態變化，如染色體易位可能導致兩個不同染色體的熒光信號在空間上出現異常的連接或融合。

3. 結果判斷標準
建立嚴格的結果判斷標準非常重要。對于熒光信號的強度、清晰度和特異性都要有明確的界定。一般要求熒光信號明亮、清晰，與背景有明顯區別。同時，要對多個細胞進行觀察和分析，以減少假陽性和假陰性結果。對于一些臨界結果，可能需要重復實驗或結合其他診斷方法進一步確認。

四、FISH 技術在診斷染色體異常中的應用

（一）常見染色體數目異常診斷

21 - 三體綜合征（唐氏綜合征）
使用 21 號染色體著絲粒探針進行 FISH 檢測，可以快速準確地檢測羊水細胞中的 21 - 三體情況。與傳統核型分析相比，FISH 技術可以在 24 - 48 小時內得出結果，大大縮短了診斷時間。在臨床實踐中，對于高齡孕婦或唐篩高風險孕婦的羊水樣本，FISH 檢測為及時發現 21 - 三體胎兒提供了有力支持。

18 - 三體綜合征（愛德華茲綜合征）和 13 - 三體綜合征（帕陶綜合征）
類似地，針對 18 號和 13 號染色體的著絲粒探針也可用于檢測相應的三體綜合征。這些染色體異常往往伴隨著嚴重的胎兒畸形和發育障礙，早期診斷可以為家庭和醫生提供決策依據，如是否選擇終止妊娠等。

（二）染色體結構異常診斷

1. 染色體易位
對于一些攜帶染色體平衡易位的夫婦，其胎兒有一定的染色體異常風險。通過使用特異性位點探針或全染色體涂抹探針，可以檢測羊水細胞中是否存在染色體易位情況。例如，在檢測羅伯遜易位時，FISH 技術可以清晰地顯示兩條近端著絲粒染色體之間的融合情況，幫助判斷胎兒是否遺傳了易位染色體，以及是否存在不平衡易位導致的基因缺失或重復。

2. 染色體缺失和重復
某些染色體微缺失和微重復綜合征（如 DiGeorge 綜合征、Prader - Willi 綜合征等）與特定染色體區域的基因缺失或重復有關。通過選擇覆蓋這些關鍵區域的探針，FISH 技術可以檢測羊水細胞中是否存在相應的染色體異常。這種檢測對于那些有家族遺傳病史或超聲檢查發現胎兒結構異常的情況尤為重要。

五、FISH 技術與傳統染色體核型分析的比較

（一）優勢

1. 快速診斷
FISH 技術可以在短時間內（一般 1 - 2 天）得出結果，而傳統核型分析需要較長時間（一般 7 - 14 天）。這對于孕周較大、需要盡快得到診斷結果的孕婦非常有利，可以及時采取相應的措施。

2. 特異性高
由于使用的是特異性探針，FISH 技術對于特定染色體異常的檢測具有很高的特異性。尤其是對于常見的三體綜合征等，其診斷準確性與傳統核型分析相當。

3. 可檢測染色體微小異常
對于一些染色體微缺失和微重復等微小結構異常，FISH 技術在選擇合適探針的情況下能夠進行檢測，而傳統核型分析可能由于分辨率的限制而難以發現。

（二）局限性

1. 檢測范圍有限
FISH 技術只能檢測已知序列的特定染色體異常，需要根據預先設計的探針來進行檢測。如果存在未知的染色體異常或探針未覆蓋的區域異常，則可能會漏診。而傳統核型分析可以對整個染色體組進行全面觀察。

2. 結果解讀相對復雜
FISH 技術的結果解讀需要對熒光信號有準確的判斷，對于一些信號不清晰或復雜的情況（如嵌合體等），解讀難度較大。而且不同實驗室之間可能存在一定的結果判斷差異，需要建立標準化的操作和解讀流程。

六、臨床案例分析

（一）病例資料

某孕婦，38 歲，孕 20 周，唐篩結果顯示 21 - 三體高風險。超聲檢查發現胎兒頸部透明層增厚。經羊膜腔穿刺獲取羊水樣本進行 FISH 檢測和傳統核型分析。

（二）檢測過程與結果

1. FISH 檢測
使用 21 號染色體著絲粒探針進行 FISH 檢測，在羊水細胞中觀察到三個明亮的熒光信號，提示 21 - 三體可能。整個 FISH 檢測過程在 24 小時內完成。

2. 傳統核型分析
同時進行的傳統核型分析在 10 天后得出結果，確診為 21 - 三體綜合征。

（三）討論

在這個案例中，FISH 技術快速地為臨床提供了初步診斷結果，為后續的咨詢和決策提供了及時的信息。雖然傳統核型分析是確診的金標準，但 FISH 技術的快速診斷優勢在這種情況下顯得尤為重要，可以避免孕婦長時間的焦慮等待。同時，兩者結果的一致性也證明了 FISH 技術在 21 - 三體診斷中的可靠性。

七、結論

熒光原位雜交技術在羊水細胞染色體異常診斷中具有重要的應用價值。它以其快速、靈敏、特異性高的特點，為產前診斷染色體異常尤其是常見的三體綜合征和部分結構異常提供了一種有效的檢測手段。雖然該技術存在一定的局限性，但與傳統染色體核型分析相結合，可以大大提高產前診斷的準確性和效率。在臨床實踐中，應根據孕婦的具體情況（如孕周、唐篩結果、超聲檢查結果等）合理選擇診斷方法，充分發揮 FISH 技術的優勢，為降低染色體異常患兒的出生率、提高人口素質做出貢獻。隨著 FISH 技術的不斷發展，如新型探針的開發、檢測流程的優化等，其在產前診斷領域的應用前景將更加廣闊。同時，也需要進一步加強實驗室質量控制和人員培訓，以確保檢測結果的準確性和可靠性。